Dalam proses menjalankan kajian genetik, kita sering menghadapi sampel RNA yang tidak mencukupi, contohnya, untuk mengkaji tumor mulut anatomi kecil, walaupun sampel sel tunggal, dan sampel mutasi gen tertentu yang ditranskripsikan pada tahap yang sangat rendah dalam sel manusia.Sudah tentu, untuk ujian COVID-19, jika sapuan tidak berada di tempat yang betul atau tidak cukup masa semasa pensampelan, saiz sampel akan menjadi sangat rendah, sebab itu Suruhanjaya Kesihatan dan Perancang Keluarga keluar dua hari lalu dan lulus ujian, dan jika pensampel asid nukleik tidak mengambil enam sampel, anda boleh melaporkannya.
Kepekaan reagen adalah penting kerana kita mempunyai masalah ini atau masalah itu, jadi apa yang boleh kita lakukan untuk meningkatkan sensitiviti RT-PCR?
Sebelum kita membincangkan penyelesaian yang mungkin, mari kita sebutkan dua komplikasi besar dengan situasi yang baru kita nyatakan.
Pertama sekali, kami bimbang tentang kehilangan RNA apabila kami hanya mempunyai beberapa populasi sel dalam sampel kami.Jika kaedah pemisahan dan pembersihan tradisional digunakan, seperti kaedah lajur atau kaedah pemendakan asid nukleik, terdapat kemungkinan besar bahawa beberapa sampel akan hilang.Satu penyelesaian ialah menambah molekul pembawa, seperti tRNA, tetapi walaupun begitu, tiada jaminan bahawa percubaan pemulihan kami adalah OK.
Jadi apakah cara yang lebih baik?Pilihan yang baik untuk sel kultur atau sampel mikroanatomi ialah menggunakan lisis langsung.
Ideanya adalah untuk membelah sel selama 5 minit, melepaskan RNA ke dalam larutan, kemudian menghentikan tindak balas selama 2 minit, kemudian menambah lisat terus ke tindak balas transkripsi terbalik supaya tiada RNA hilang, dan akhirnya meletakkan cDNA yang terhasil secara langsung ke dalam tindak balas masa nyata.
Tetapi bagaimana jika, kerana titik permulaan yang terhad atau sedikit ekspresi gen sasaran, kita boleh mengitar semula semua RNA dan masih tidak menyediakan templat yang mencukupi untuk mendapatkan isyarat masa nyata yang baik?
Dalam kes ini, langkah pra-penguatan boleh menjadi sangat berguna.
Berikut ialah skema untuk meningkatkan sensitiviti selepas transkripsi terbalik.Sebelum memulakan, kita perlu bertanya hiliran sasaran yang kita minati, untuk mereka bentuk primer khusus untuk sasaran ini untuk pra-penguatan.
Ini boleh dicapai dengan mencipta primer campuran dengan sehingga 100 pasang primer dan kitaran tindak balas 10 hingga 14 kali.Oleh itu, Campuran Induk yang direka khusus untuk keperluan ini diperlukan untuk pra-menguatkan cDNA yang diperolehi.
Sebab untuk menetapkan bilangan kitaran antara 10 dan 14 ialah bilangan kitaran yang terhad ini memastikan rawak antara pelbagai sasaran, yang penting bagi penyelidik yang memerlukan maklumat molekul kuantitatif.
Selepas pra-penguatan, kita boleh mendapatkan sejumlah besar cDNA, supaya sensitiviti pengesanan di bahagian belakang bertambah baik, malah kita boleh mencairkan sampel dan melakukan tindak balas PCR masa nyata berbilang untuk menghapuskan kemungkinan ralat rawak.
Masa siaran: Apr-11-2023